CCK8检测细胞增殖/毒性的原理、方法及注意事项
发布时间:2015-6-4
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 一、CCK8检测细胞增殖/毒性的原理

 
 
Cell Counting Kit-8(简称CCK-8)试剂可用于简便而准确的细胞增殖和毒性分析。其基本原理为:该试剂中含有WST-8【化学名:2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐】,它在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯(1-Methoxy PMS)的作用下被细胞中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲瓒产物(Formazan dye)。生成的甲瓒物的数量与活细胞的数量成正比。因此可利用这一特性直接进行细胞增殖和毒性分析。


用途:药物筛选、细胞增殖测定、细胞毒性测定、肿瘤药敏试验

CCK8的优点
  • 使用方便,省去了洗涤细胞,不需要放射性同位素和有机溶剂;
  • CCK-8法能快速检测;
  • CCK-8法的检测灵敏度很高,甚至可以测定较低细胞密度;
  • CCK-8法的重复性优于MTT 法;
  • CCK-8法对细胞毒性小;
  • CCK-8细胞活性检测试剂中为1瓶溶液,毋需预制,即开即用。

CCK8的缺点
  • 与MTT法相 比,CCK8和XTT的价格比较贵。
  • CCK8试剂的颜色为淡红色,与含酚红的培养基颜色接近,不注意的话容易产生漏加或多加。


与以往的增殖/毒性测定试剂相比较

检测方法
MTT法
XTT法
WST-1法
CCK8法
甲臢产物的水溶性
差(需加有机溶剂溶解)
产品性状
粉末
2瓶溶液
溶液
1瓶溶液
使用方法
配成溶液后使用
现配现用
即开即用
即开即用
检测灵敏度
很高
很高
检测时间
较长
较短
较短
最短
检测波长
560-600nm
420-480nm
420-480nm
430-490nm
细胞毒性
高,细胞形态完全消失
很低,细胞形态不变
很低,细胞形态不变
很低,细胞形态不变
试剂稳定性
一般
较差
一般
很好
批量样品检测
可以
非常适合
非常适合
非常适合
便捷程度
一般
便捷
便捷
非常便捷


二、CCK8检测细胞增殖/毒性的方法

实验一:细胞增殖分析

1、制备细胞悬液:细胞计数
2、接种到96孔板中:根据合适的铺板细胞数,每孔约100ul细胞悬液,同样的样本可做3个重复。
3、37℃培养箱中培养:细胞接种后贴壁大约需要培养2-4小时,如果不需要贴壁,这步可以省去。
4、加入10ul CCK8:由于每孔加入CCK8量比较少,有可能因试剂沾在孔壁上而带来误差,建议在加完试剂后轻轻敲击培养板以帮助混匀。或者直接配置含10%CCK8的培养基,以换液的形式加入。
5、培养1-4小时:细胞种类不同,形成的Formazan的量也不一样。如果显色不够的话,可以继续培养,以确认最佳条件。特别是血液细胞形成的Formazan很少,需要较长的显色时间(5-6小时)。

6、测定450nm吸光度:建议采用双波长进行测定,检测波长450-490nm,参比波长600-650nm。

实验二:细胞毒性分析
1、制备细胞悬液:细胞计数
2、接种到96孔板中:根据合适的铺板细胞数,每孔约100ul细胞悬液,同样的样本可做3个重复。
3、37℃培养箱中培养:细胞接种后贴壁大约需要培养2-4小时,如果不需要贴壁,这步可以省去。
4、加入不同浓度的毒性物质
5、37℃培养箱中培养:加入毒性物质的培养时间,要看毒性物质的性质和细胞的敏感性,一般要根据细胞周期来决定,起码要一代以上的时间。
6、加入10ul CCK8:由于每孔加入CCK8量比较少,有可能因试剂沾在孔壁上而带来误差,建议在加完试剂后轻轻敲击培养板以帮助混匀。
7、培养1-4小时:细胞种类不同,形成的Formazan的量也不一样。如果显色不够的话,可以继续培养,以确认最佳条件。特别是血液细胞形成的Formazan很少,需要较长的显色时间(5-6小时)。
8、测定450nm吸光度:建议采用双波长进行测定,检测波长450-490nm,参比波长600-650nm。


注:

  • 若暂时不测定OD值,可以向每孔中加入10 μL 0.1M的HCL溶液或者1% w/v SDS溶液,并遮盖培养板避光保存在室温条件下。24小时内测定,吸光度不会发生变化。
  • 如果待测物质有氧化性或还原性的话,可在加CCK8之前更换新鲜培养基(除去培养基,并用培养基洗涤细胞两次,然后加入新的培养基),去掉药物影响。当然药物影响比较小的情况下,可以不更换培养基,直接扣除培养基中加入药物后的空白吸收即可。



三、CCK8检测细胞增殖/毒性的注意事项


  • 当使用标准96孔板时,贴壁细胞的最小接种量至少为1,000 个/孔 (100 μl 培养基)。检测白细胞时的灵敏度相对较低,因此推荐接种量不低于2,500 个/孔 (100 μl 培养基)。
  • 酚红和血清对CCK8法的检测不会造成干扰,可以通过扣除空白孔中本底的吸光度而消去。
  • CCK8可以检测大肠杆菌,但不能检测酵母细胞。在细胞增殖实验每次测定的过程中需要避免细菌污染,以免影响结果。
  • CCK-8在0-5℃下能够保存至少6个月,在-20℃下避光可以保存1年。
  • 当在培养箱内培养时,培养板最外一圈的孔最容易干燥挥发,由于体积不准确而增加误差。一般情况下,最外一圈的孔只加培养基,不作为测定孔用。
  • 在培养基中加入CCK8,培养一定的时间,测定450 nm的吸光度即为空白对照。在做加药实验时,还应考虑药物的吸收,可在加入药物的培养基中加入CCK8,培养一定的时间,测定450 nm的吸光度作为空白对照。
  • 金属对CCK-8显色有影响:当终浓度为1 mM的氯化亚铅、氯化铁、硫酸铜会抑制5%、15%、90%的显色反应,使灵敏度降级。如果终浓度是10 mM的话,将会100%抑制。
  • 悬浮细胞由于染色比较困难,一般需要增加细胞数量和延长培养时间。
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