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Western Blot印迹膜的选择
发布时间:2012-12-30
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摘要: 印迹法主流,无论是SouthernNorthern还是Western Blot,都需要将电泳结果转印到膜上固定,再进行显色显影反应。对于各种Blot来说,作为承载实验结果的载体,包括各类斑点杂交或者克隆转印,膜的选择就显得很重要。

    除了个别在PAGE胶上利用荧光或者酶活性直接做类似Western反应的“前卫”方法,印迹法的常规主流,无论是SouthernNorthern还是Western Blot,都需要将电泳结果转印到膜上固定,再进行显色显影反应。对于各种Blot来说,作为承载实验结果的载体,包括各类斑点杂交或者克隆转印,膜的选择就显得很重要。

    德国老牌的厂家Schleicher & Schuell是世界第一个生产硝酸纤维素膜的厂家,其产品标准即为同类产品的行业标准,产品质量毋庸置疑,去年被对手之一的Whatman收购而成为Whatman旗下产品。不过由于这个牌子的产品品种颇多,初次选择时不免让人眼花缭乱,生物通小编在这里特别介绍一下,便于大家选择。

硝酸纤维素膜:

    Protran:纯的硝酸纤维素膜。在所有膜中,Protran膜的封闭最简单容易,从而可有效阻断非特异结合,降低背景,无需严谨清洗即可得到良好的信噪比;广泛适用于同位素、化学发光法、显色法和荧光法等不同的标记显色方法,适用于包括SouthernNorthernWestern Blot在内的多种实验。对于基于HRP的化学发光法印迹反应,效果尤佳。不过,由于是纯硝酸纤维素膜,比较脆,操作上要特别注意。Protran孔径分为0.45μm0.2μm0.1μm3种。0.45μm膜通常适用于分子量大于20KD的蛋白分子和300bp以上大小的核酸;而0.2μm膜则由于密度大孔径小能有效减少“渗漏”,更适用于分子量小于20KD的蛋白质分子,包括300bp以下的短链DNA或者寡核苷酸。而0.1μm膜则是用来对付7KD以下的蛋白质小家伙们的。如果你的实验中的小分子蛋白质Western Blot老做不好(比如EGF),大概有可能就是膜的孔径不够小,漏掉拉(当然电泳Buffer不用甘氨酸也是窍门之一)。硝酸纤维素膜不需要甲醇预先浸润,用前直接铺在在水面渗透润湿后就可以使用。Protran的另外一个小小优点是非常稳定,5年前保存Western Blot的实验结果在历时5年后再次做显色反应,依然能正确显色。虽说需要重复用到5年前结果的,好像很少见,但能说明其性质稳定,可保存蛋白质。

    在操作上,除了小心之外,Protran硝酸纤维素膜适用于常规电转、半干转、真空转、毛细转移,但不适合用碱法。固定方法,如果样本是核酸,可以用紫外交联或者80度烘干固定,蛋白质则只需要干燥固定即可。Protran适用于各种通用的显色方法如化学显色,化学发光,同位素和荧光法。

    Optitran:夹心的硝酸纤维素膜,中间的聚酯基质两面均匀覆盖硝酸纤维素,使得该种膜具有硝酸纤维素膜的所有优点同时兼具强韧性,特别适合需要反复操作的实验,比如需要多次重复标记杂交和重复洗脱的实验----有时候对同一个电泳结果需要Western检测多个目标蛋白,在检测第一个目标蛋白后,可用酸洗(如0.2MGlycine/0.5MNaCl,pH2.82-5minTris中和,从而洗脱第一个目标蛋白抗体,再进行第二个目标抗体的检测,Optitran的强韧的高耐受性正好适合这类重复操作的要求。Optitran0.45μm0.2μm两种孔径规格提供,除了单位面积最大载量相对Protran会小一些,其他选择和使用和Protran都是一样的。Optitran由于带有聚酯,通常不推荐用荧光检测。

PVDF

    Westran S:很高的蛋白质结合效率和载量,即使很剧烈的反复洗涤条件也不影响目标蛋白结合。0.2μm小孔径,防蛋白质渗漏。最重要的是,PVDF膜化学性质稳定,可以兼容测序----将蛋白条带剪下可以直接去N端测序。如果需要做蛋白质测序,PVDF是最佳选择。

    Westran Clear Signal:和小S的区别是孔径,这个是0.45μm,其他特性一样,专为蛋白质Western用的。由于孔径大,转移速度也比较快,截留的背景更少,信号就更清晰。CS可以兼容常规的蛋白燃料,比如丽春红,氨基黑,靠马斯亮蓝染色。

    PVDF膜用前需要“飘在”甲醇液面浸润(通风橱操作),然后才能进行下一步。转移方法适用于半干转或者电转,其他不适合。而固定的方法主要采用干燥固定。显色,包括化学发光法和同位素,化学显色法,都适合PVDF膜。

尼龙膜

  Nytran SuPerCharge:带高正电荷的尼龙膜。尼龙膜柔软,强韧,耐折叠,可耐受强度较高的机械操作,这一点上远胜于硝酸纤维素膜,并因而广泛用于膜芯片,Macroarray,或者预制核酸杂交膜上。通常核酸分子在电泳条件下是带负电,尼龙膜上电荷越高,吸附带负电的核酸分子的能力越强,不过蛋白质荷电特性与核酸不同,尼龙膜更常见用于Southern或者NorthernNytran SuPerCharge经过特殊处理,均匀附着在中间介质两面,表面孔径均一,电荷量是常规带正电核酸膜的3倍,对核酸的吸附更强,更重要的是经过特殊处理,克服以往带电尼龙膜背景高的弱点,能得到良好的信噪比。

    尼龙膜适用于各种转移方法,如电转,半干转,毛细管,碱法等,固定方法是紫外交联。不过就不太适合化学显色和荧光检测。因为尼龙本身有荧光,会干扰结果;而化学显色剂的微小颗粒容易附着而产生斑点背景。

    Nytran同样分0.45μm0.2μm孔径,分别适合300bp以上或者以下的核酸片段。选择的标准是看你的核酸大小。

    Nytran N是常规带正等电荷的尼龙膜。除了荷电小其他特性和差不多,如果你不详要高电荷,这个就是一选择。

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