Gibco FreeStyle™ MAX试剂（货号16447100）
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名称
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品牌
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货号
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规格
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保存
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FreeStyle™ MAX试剂
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Gibco
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16447100
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1mL
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4°C
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一、产品概述
FreeStyle™MAX试剂是一种专有的非动物源性制剂，用于将质粒DNA转染到真核细胞中，其可轻松扩大以生产大量重组蛋白。FreeStyle™MAX试剂可在生物生产应用中获得极高表达水平和转染率，细胞毒性较低，并经过特殊配制可与以下产品配合使用：
•无血清FreeStyle™293表达培养基(货号12338-018)中的FreeStyle™293-F细胞(悬浮人胚肾细胞，货号R790-07)。
•无血清FreeStyle™CHO表达培养基(货号12651-014)中的FreeStyle™CHO-S细胞(悬浮中国仓鼠卵巢细胞，货号R800-07)。
•含8mML-谷氨酰胺和18mL/L 10% Pluronic™F-68的CD DG44培养基(货号A11000-01)中的DG44细胞(DHFR–悬浮CHO细胞)。
产品用途：
FreeStyle™MAX试剂预期用于与FreeStyle™MAX293表达系统(货号K9000-10)和FreeStyle™MAX CHO表达系统(货号 K9000-20)配合使用。
二、产品规格
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分类
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无动物来源
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适用于（应用）
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转染
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高通量能力
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不兼容高通量应用（手动）
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产品线
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Freestyle™
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产品类型
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转染试剂
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数量
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1mL
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血清兼容性
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是
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运输条件
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湿冰
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细胞类型
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已建立的细胞系
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样品类型
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质粒 DNA
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转染技术
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脂质体介导转染
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Unit Size
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Each
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三、应用范围
1.适用于FreeStyle™ 293-F细胞、FreeStyle™ CHO-S细胞等悬浮培养的哺乳动物细胞系。
2.用于瞬时转染以高效表达重组蛋白，如抗体、酶、细胞因子等。
3.可用于蛋白质功能研究、结构生物学、药物筛选及小规模重组蛋白制备。
四、产品操作指南
（1）材料准备
•FreeStyle™293-F细胞、FreeStyle™CHO-S™细胞或DG44细胞
•FreeStyle™293表达培养基、FreeStyle™CHO表达
•培养基或DG44培养基
•带通风瓶盖的Erlenmeyer烧瓶
•温度和CO 2受控培养箱中的轨道振荡器
•质粒DNA
•OptiPRO™ SFM
（2）重要指南
1.DNA-FreeStyle™MAX复合物必须在OptiPRO™SFM中制备，可直接添加至培养基中的细胞。
2.在湿度为37°C、CO 浓度为2%的环境中，使用轨道摇床悬浮培养FreeStyle™293-F和FreeStyle™CHO-S™细胞或DG44细胞。
（3）FreeStyle™细胞的转染条件
•最终转染体积：30 mL
•转染细胞数量：3×107
•质粒DNA量：37.5µg
•FreeStyle™MAX试剂量：37.5µL
（4）方案大纲
A. 解冻后至少传代三次的培养细胞。
B. 制备并添加DNA-脂质复合物至细胞中。
C. 将细胞培养1-7天。
D. 收获。
（5）转染FreeStyle™293-F或FreeStyle™CHO-S™细胞详细方案
使用以下方案转染悬浮细胞。所有用量均以每瓶为单位给出，适用于125 mL摇瓶中的30 mL培养物。
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步骤
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程序详情
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展开单元格
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对于每次30mL转染，您需要在30mLFreeStyle™293表达培养基或FreeStyle™CHO表达培养基中加入3××107个细胞。
对于FreeStyle™293-F细胞：转染前一天，传代至6-7×10⁵个细胞/mL；以120-135rpm振摇。
FreeStyle™CHO-S ™细胞：转染前一天，传代至5-6×10⁵个细胞/mL；以120-135rpm振摇。
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细胞计数和活力测定
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用台盼蓝染色排除法测定少量细胞的活力和聚集体。用自动细胞计数器或血细胞计数板进行细胞计数。在转染当天，细胞密度应为1.2-1.5××106个/mL，存活率>95%。
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培养瓶中的种子细胞
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将细胞稀释至1×10⁴个/mL。每次30mL转染需要3×107个细胞。
对于每个30mL转染，使用新鲜、预热的FreeStyle™293表达培养基或FreeStyle™CHO表达培养基，使总体积达到30mL。
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制备DNA-脂质复合物
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按如下方法制备DNA-脂质复合物：
a. 将37.5 μg质粒DNA溶于OptPRO™SFM低浓度血清培养基中，使总体积为0.6mL。轻轻混合。
b. 取37.5 μL mL的FreeStyle™MAX试剂，用OptPRO™SFM稀释至总体积为0.6mL。轻轻混合，室温下孵育5分钟。孵育时间超过5分钟可能导致活性降低。
c. 孵育5分钟后，将稀释的DNA加入到稀释的试剂中，使总体积达到1.3mL。轻轻混合。
d. 在室温下孵育20-30分钟，以使DNA-脂质复合物形成。
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向细胞中添加DNA-脂质复合物
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向每个细胞悬液瓶中加入1.2mL复合物。每瓶总体积为30mL。含有约1×10⁶个活细胞/mL。
向阴性对照培养瓶中加入2mL还原血清培养基，而不是复溶液。
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孵育
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温度37℃
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湿润的空气 空气中8%CO2
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轨道式振荡台 125 rpm
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收获细胞或培养基
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重组蛋白表达检测。在转染后1-7天进行此步骤。如果重组蛋白是分泌的，则收集培养基而不是细胞。
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（6）转染DG44细胞以生成稳定细胞系详细方案
使用本程序将线性化DNA转染至DG44细胞。所有用量均按每瓶计算，适用于125毫升摇瓶中30毫升的培养物。
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步骤
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程序
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制备和培养DG44细胞
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a. 以3×10⁵个细胞/mL的密度对细胞进行传代。
b. 在37℃下以130-135 rpm的转速振荡，CO含量为3%。 c. 在CD DG44培养基（货号：12610-010）中进行培养，其中含有8 mM L-谷氨酰胺（货号：25030-081）和18 mL/L的10% Pluronic™F-68（货号：24040-032）。 |
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再次通过DG44细胞
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再次以3×107个细胞/mL的密度通过细胞。
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制备细胞
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细胞计数。细胞活力应>95%。
在每个培养瓶中，加入1.5×106个细胞，总体积为30mL CD DG44培养基。 |
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脂质与线性化DNA的结合
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轻轻翻转试管以混合试剂，然后向1.2mL OptiPRO™SFM（室温）中加入18μg线性化DNA和15μg FreeStyle™MAX试剂，并轻轻翻转以混合。
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孵育DNA-脂质混合物
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在室温下孵育10分钟，但不超过20分钟。
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向细胞中添加DNA-脂质混合物
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将1.2mL混合液缓慢加入到含有细胞的125mL烧瓶中，同时缓慢旋转烧瓶。
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孵育
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温度37℃
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湿润的空气空气中8%CO2
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轨道式振动物台130~135rpm
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将细胞置于选择性培养基上
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将细胞置于选择性培养基（例如，CD OptiCHO™培养基，货号：12681-011）上。
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五、常见问题解答
1.FreeStyle Max试剂相对于293fectin转染试剂的优势是什么？
FreeStyle Max试剂与293fectin转染试剂能够提供水平相近的高转染效率；不过，FreeStyle Max试剂具有更低的细胞毒性，进而能够实现更高的蛋白得率。此外，FreeStyle Max试剂为非动物源性的。
2.培养于FreeStyle 293表达培养基中的FreeStyle 293-F细胞能使用ExpiFectamine293试剂和增强剂进行转染吗？如果可以，转染效率会比使用FreeStyle Max试剂更高吗？
您可使用ExpiFectamine293试剂来转染FreeStyle 293表达培养基中培养的FreeStyle 293-F细胞；不过，增强剂只会对蛋白表达提供少许的促进作用，因为这一产品是针对更高密度培养设计的，而FreeStyle 293表达培养基并不适用。
3.我不慎将我的脂质体试剂留在了室温条件下，还能继续使用吗？
可以，我们所有的脂质体转染试剂均能够在室温下稳定保存数月。
4.反向转染与正向转染之间区别是什么？我该如何选择？
在正向转染过程中，细胞铺于培养孔之中，用通常的方式制备转染复合物并在第二天将其加入细胞培养物中。在反向转染过程中，在培养孔之中制备转染复合物，之后再加入细胞与培养基。反向转染比正向转染过程更迅速，因此是高通量转染的理想之选。在非高通量的转染操作中，通常正向转染对于大多数类型的细胞转染效果更佳。
5.转染过程中的培养基可使用抗生素么？
可以，转染过程中可在培养基中添加抗生素（青霉素-链霉素）。我们对多个细胞系在含与不含抗生素的培养基中的转染效果进行了比较，同时评估其转染效率和细胞毒性，结果显示并无差别。不过，某些细胞类型对转染过程敏感或可能出现细胞毒性方面的问题，此时省略抗生素可能会有助于改善结果。对稳定转染而言，转染操作后至少等待48小时以上，再加入选择性抗生素。
六、内容与储存
每单位包含一小瓶试剂。储存在 4°C下，请勿冷冻。妥善储存时，保证FreeStyle™MAX稳定储存6个月。
七、引用和文献
Transient transfection factors for high-level recombinant protein production in suspension cultured mammalian cells.
Authors:Liu C, Dalby B, Chen W, Kilzer JM, Chiou HC,
Journal:Mol Biotechnol
PubMed ID:18327552。
北京
